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BEL-7404人肝癌細胞實驗操作步驟

細胞傳代與擴增

當細胞密度達到80%-90%時即可傳代。棄去舊培養基，用預冷的PBS輕柔洗滌2次，加入0.25%（含0.02% EDTA）1mL，37℃消化1-2分鐘。鏡下觀察細胞回縮變圓后，立即加入2mL培養基終止消化，輕柔吹打形成單細胞懸液。1000rpm離心5分鐘，棄上清，用新鮮培養基重懸后按1:2~1:3比例分至新培養瓶，補充培養基至3mL/瓶，標記好代次與日期。

凍存與復蘇

凍存液配制：培養基與DMSO按9:1比例混合，4℃預冷。取對數生長期細胞，按傳代方法消化后計數，調整密度至5×10?/mL，與凍存液1:1混合分裝至凍存管，標注細胞名稱、代次、日期。采用梯度降溫法：4℃ 30min→-20℃ 2h→-80℃過夜，最后轉入液氮長期保存。復蘇時快速將凍存管置入37℃水浴，融化后轉移至15mL離心管，加5mL預溫培養基稀釋，離心去上清，重懸后接種至培養瓶。

實驗質量控制

（1）定期檢測支原體污染（每2月1次），推薦使用PCR法；

（2）傳代時保留細胞形態照片，異常形態需排查污染或代謝問題；

（3）關鍵實驗前需進行活力檢測（臺盼藍染色法活細胞率應>95%）；

（4）建立細胞生長曲線，記錄群體倍增時間（PDT），BEL-7404正常PDT為24±2小時。

注意事項

（1）所有操作需在超凈臺內完成，避免交叉污染；

（2）消化時間根據細胞狀態動態調整，過度消化會導致細胞損傷；

（3）凍存細胞復蘇后換液需保留50%原培養基；

（4）實驗數據需記錄培養基批號、血清來源等關鍵參數。

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